猪蓝耳病亦称猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖障碍和呼吸道传染病，临床主要表现为妊娠母猪繁殖障碍，妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎;仔猪主要表现为间质性肺炎等症状。本病于20世纪80年代在美国首次流行以来，迅速传遍世界主要养猪国家，中国于1995年发现该病，是威胁我国当前养猪业持续健康发展的主要疫病之一，加强该病的分析研究和综合防控，对生猪生产稳定发展意义重大。2016年12月，四川眉山某猪场暴发疑似猪繁殖与呼吸综合征疫情，发病猪呼吸困难，剖检肺部病变明显，送至四川农业大学动物生物技术中心进行实验室检测。
1.1 临床样品采集
2016年12月，四川眉山某猪场发生疑似PRRS，主要表现为仔猪食欲减退、高热，体温41
℃，轻微腹泻以及严重的呼吸道症状，剖检可见肺部间质性肺炎，全身淋巴结轻度水肿。通过临床特征和病理解剖初步判断为PRRS。采集发病猪血清以及肺脏、淋巴结和脾脏等组织冷藏保存，送实验室进行PRRSV的RT-PCR诊断。
1.2 主要仪器和材料
Mastercycler PCR 扩增仪、Gel Doc 2000 凝胶图像分析系统、2×Taq Plus PCR
MasterMix有限公司，反转录试剂盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker。
1.3 引物设计与合成
本实验所使用引物如表1所示，所有引物由生工生物工程股份有限公司合成。
1.4 病料处理及RNA的抽提
取采集病料0.5～2.0 g 研磨，并按1∶3
比例加入生理盐水配成病料悬液，随后反复冻融3次。冻融后按12 000 r/min
离心5 min
后取上清液，按照Trizol法提取RNA，并将提取的RNA按照反转录试剂盒方法制成cDNA保存备用。
1.5 RT-PCR检测
取1μL cDNA于PCR管中，然后分别加入引物P1、P2和P3各10 pmol，2×PCR Master
Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，混匀后置PCR仪中按照以下程序进行扩增：95
℃，1min;95℃,5s,57℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40个循环;72 ℃ 1 min;
PCR结束后取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
1.6 Nsp2和ORF5基因扩增
以1.5反转录的cDNA为模板，分别加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物，2×PCR
Master Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，扩增Nsp2高变区和ORF5基因。
PCR扩增结束后用1%琼脂糖凝胶电泳、电压100 V、30～50
min后观察结果，按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段，与pMD19-T Simple
Vector载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取白色菌落，接种于LB液体培养基中培养后提取质粒，经NcoI、BamH
I双酶切及PCR鉴定，阳性菌液保存备用。
1.8 序列测定及分析
将含目的DNA的阳性菌液送至宝生物工程有限公司进行测序。采用DNAStar软件对Nsp2基因、ORF5基因序列与GenBank中收录的PRRSV的Nsp2基因、ORF5
基因序列的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析，应用ClustalX、Mega 4.1
软件绘制进化树。